laporan biokimia protein

PROTEIN

I.          Tujuan

1.      Mengidentifikasi adanya protein dalam sampel.

2.      Menentukan ikatan protein pada sampel

3.      Mengetahui ikatan kation besar yang dapat merusak muatan negatif protein.

II.       Prinsip

1.      Uji Ninhidrin : Berdasakan pada uji Ninhidrin yang membentuk aldehid yang lebih rendah.

2.      Uji Biuret : Berdasarkan pada uji Biuret untuk mengetahui ikatan peptida dalam suatu protein.

3.      Pengendapan dengan logan berat : Berdasarkan pada pengendapan dengan logam berat pada kation besar yang dapat muatan negatif dari protein sehingga terjadi pengendapan.

III.    Reaksi

1.      Uji Ninhidrin

2.      Uji Biuret

3.      Reaksi protein dengan logam berat

 

IV.       Teori

Protein adalah molekul raksasa yang terdiri dari satuan-satuan kecil penyusunnya yang disebut asam amino yang tersusun dalam urutan tertentu, dengan jumlah dan struktur tertentu. Molekul-molekul ini merupakan bahan pembangun sel hidup. Protein yang paling sederhana terdiri atas 50 asam amino, tetapi ada beberapa protein yang memiliki ribuan asam amino. Hal yang terpenting adalah ketidak hadiran, penambahan, atau penggantian satu saja asam amino pada sebuah struktur protein dapat menyebabkan protein tersebut menjadi gumpalan molekul yang tidak berguna. Setiap asam amino harus terletak pada urutan yang benar dan struktur yang tepat.

Struktur asam amino secara umum adalah satu atom C yang mengikat empat gugus: gugus amina (NH₂), gugus karboksil (COOH), atom hidrogen (H), dan satu gugus sisa (R, dari residue) atau disebut juga gugus atau rantai samping yang membedakan satu asam amino dengan asam amino lainnya. Atom C pusat tersebut dinamai atom C_α ("C-alfa") sesuai dengan penamaan senyawa bergugus karboksil, yaitu atom C yang berikatan langsung dengan gugus karboksil. Oleh karena gugus amina juga terikat pada atom C_α ini, senyawa tersebut merupakan asam α-amino. Asam amino biasanya diklasifikasikan berdasarkan sifat kimia rantai samping tersebut menjadi empat kelompok. Rantai samping dapat membuat asam amino bersifat asam lemah, basa lemah, hidrofilik jika polar, dan hidrofobik jika nonpolar.

Dari struktur umumnya, asam amino mempunyai dua gugus pada tiap molekulnya, yaitu gugus amino dan gugus karboksil, yang digambarkan sebagai struktur ion dipolar. Gugus amino dan gugus karboksil pada asam amino menunjukkan sifat-sifat spesifiknya. Karena asam amino mengandung kedua gugus tersebut, senyawa ini akan memberikan reaksi kimia yang yang mencirikan gugus-gugusnya. Sebagai contoh adalah reaksi asetilasi dan esterifikasi. Asam amino juga bersifat amfoter, yaitu dapat bersifat sebagai asam dan memberikan proton kepada basa kuat, atau dapat bersifat sebagai basa dan menerima proton dari basa kuat.

Sifat – sifat protein :

1.      Ionisasi : protein yang larut dalam air akan membentuk ion yang mempunyai muatan positif dan negative

2.      Denaturasi : perubahan konformasi alamiah menjadi suatu konformasi yang tidak menentu

3.      Viskositas : suatu larutan protein dalam air mempunyai viskositas atau kekentalan yang relatif lebih besar daripada viskositas air sebagai pelarutnya.

4.      Kristalisasi : sering dilakukan dengan jalan penambahan garam aminosulfat atau NaCl pada larutan dengan pengaturan pH pada titik isolistriknya

5.      Sistem koloid : protein mempunyai molekul besar dan karenanya larutan protein bersifat koloid

Ada 4 tingkat struktur protein yaitu struktur primer, struktur sekunder, struktur tersier dan struktur kuartener.

1.      Struktur primer protein 

Protein yang dibentuk dengan asama amino tergabung dalam ikatan polipeptida.  Setiap asam amino terhubung dengan asam amino lainnya dalam ikatan peptida yang terbentuk karena adanya  reaksi kondensasi gugus karboksil pada setiap masing-masing asam amino. Struktur Asam amino primer. Pada ujung dari rangkaian polipeptida yang terbentuk mempunyai sifat kimia yang berbeda: satu ujung mempunyai gugus amino bebas (N atau amino, NH2-) disisi satunya, sedangkan mempunyai gugus karboksil bebas (ujung C atau karboksil, COOH-) pada ujung satunya. Oleh karena itu, arah polipeptida dan dituliskan baik N→C (kiri ke kanan) maupun C →N (kanan ke kiri).

2.      Struktur Sekunder protein

Pada struktur sekunder, rangkaian polipeptida memiliki konformasi yang berbeda. Bersifat reguler dan memiliki pola lipatan berulang dari rangka protein. Dua tipe umum struktur protein sekunder yaitu α-heliks dan β-sheet. Keduanya terbentuk karena ikatan hidrogen yang terjadi antara asam amino yang berbeda pada polipeptida.

3.      Struktur Tersier

Struktur polipeptida yang terjadi dari lipatan komponen struktur sekunder polipeptida yang membentuk konfigurasi tiga dimensi. Bermacam-macam gaya ikatan hidrogen antar asam amino yang terjadi pada rangkaian polipeptida inilah maka disebur struktur tersier. Disertai gaya hidrofobik rangkaian ini menempatkannya (asam amino gugus non-polar) dibagian dalam protein dengan tujuan melindunginya dari air. Selain ikatan hidrogen, terdapat juga ikatan kovalen yang disebut juga sebagai jembatan disulfide antara asam amino sistein di berbagai macam posisi pada rangkaian polipeptida.

4.      Struktur Kuartener Protein

Asosiasi yang terjadi antara dua atau lebih rangkaian polipeptida, dimana masing-masing terlipat menjadi struktur tersier, menjadi protein multisubunit. Tidak semua protein membentuk struktur kuaternair. Antara rangkian polipeptida yang berbeda struktur protein terikat dengan jembatan disulfide. Sedangkan pada protein yang terdiri dari asosiasi subunit yang lebih lemah akan dihubungkan dengan ikatan hidrogen dan efek hidrofobik. Protein ini dapat kembali pada komponen polipeptidanya, atau berubah komposisi subunitnya tergantung pada kebutuhan fungsinya. Singkatnya, struktur kuartener menggambarkan subunit-subunit yang berbeda dipak bersama-sama membentuk struktur protein.

Denaturasi protein adalah hilangnya sifat-sifat struktur lebih tinggi oleh terkacaunya ikatan hidrogen dan gaya-gaya sekunder lain yang memutuskan molekul protein. Akibat dari suatu denaturasi adalah hilangnya banyak sifat-sifat biologis suatu protein.

Salah satu penyebab denaturasi protein adalah perubahan temperatur, dan juga perubahan pH. Faktor-faktor lain yang dapat menyebabkan denaturasi adalah detergent, radiasi zat pengoksidasi atau pereduksi, dan perubahan jenis pelarut. Denaturasi dapat bersifat reversibel, jika suatu protein hanya dikenai kondisi denaturasi yang lembut seperti perubahan pH. Jika protein dikembangkan kelingkungan alamnya, hal ini untuk memperoleh kembali struktur lebih tingginya yang alamiah dalam suatu proses yang disebut denaturasi. Denaturasi umumnya sangat lambat atau tidak terjadi sama sekali. Denaturasi protein juga dapat diartikan suatu proses terpecahnya ikatan hydrogen, ikatan garam atau bila susuna  ruang atau rantai polipeptida suatu molekul protein berubah. Dengan perkataan lain denaturasi adalah terjadi kerusakan struktur primer, sekunder, tersier dan struktur kuarterner, tetapi struktur primer (ikatan peptida) masih utuh.

Metode pengujian kualitatif protein

1.      Uji Ninhidrin

Ninhidrin adalah suatu senyawa oksidator kuat yang apabila bereaksi dengan asam α amino akan menghasilkan warna ungu. Reaksi ini terjadi dengan senyawa amin primer dan ammonia tanpa pembebasan CO. Reaksi ninhidrin digunakan untuk mengetahui adanya kandungan asam α-amino. Ninhidrin adalah suatu reagen yang berguna untuk mendeteksi asam amino dan menetapkan konsentrasinya dalam larutan. Apabila bereaksi dengan asam amino menghasilkan zat berwarna ungu. Reagen ini dapat menyebabkan iritasi saluran pernafasan. Berbahaya jika tertelan dan berbahaya jika diserap melalui kulit atau terhirup. Biuret adalah reagen yang digunakan untuk mendeteksi adanya ikatan peptida. Dalam uji biuret ini terdapat 2 reagen, yakni CuSO₄ dan NaOH. Reagen-reagen ini dapat berbahaya jika tertelan, dapat menyebabkan gangguan pencernaan dan iritasi saluran pernafasan dengan luka bakar, menyebabkan iritasi mata dan kulit dan luka bakar, higroskopis, mutagen dan kemungkinan sensitizer.

2.      Uji Biuret

Pada uji biuret, ketika beberapa tetes larutan CuSO4 yang sangat encer ditambahkan pada alkali kuat dari peptida atau protein dihasilkan warna ungu, adalah test yang umum untuk protein dan diberikan oleh peptida yang berisi dua atau lebih rantai peptida. Biuret dibentuk dengan pemanasan urea dan mempunyai struktur mirip dengan struktur peptida dari protein.

3.      Uji pengendapan dengan logam

Pada pH di atas titik isoelektrik protein bermuatan negative, sedangkan di bawah titik isoelektrik protein bermuatan positif. Olehkarena itu untuk mengendapkan protein dengan ion logam diperlukan pH larutan di atas titik isoelektrik, sedangkan untuk pengendapan protein dengan ion negative memerlukan pH larutan di bawah titik isoelektrik. Ion- ion positif yang dapat mengendapkan protein adalah Ag⁺, Ca²⁺, Zn²⁺, Hg²⁺,Pb²⁺,Cu²⁺,Fe²⁺. Sedangkan ion-ion negative yang dapat mengendapkan protein adalah ion salisilat, trikloroasetat, pikrat, tanat dan sulfosalisilat.

V.       Alat dan Bahan

5.1  Alat yang digunakan

1.      Tabung reaksi

2.      Gelas ukur

3.      Pipet tetes

4.      Penangas air

5.2  Bahan yang digunakan

1.      Buffer asetat pH 5

2.      Larutan NaOH 10%

3.      CuSO4 0,1%; 0,2%; 2%

4.      Pb asetat 2%

5.      HgCl2 2%

6.      FeCl 2%

7.      Kasein 0,5%

8.      Buffer asetat pH 6,0; 5,3; 5,0; 4,1; 3,8

VI.       Prosedur

1.      Uji Ninhidrin

Didalam 0,1 mL larutan 2% albumin (putih telur) ditambahkan 1mL 0,1N larutan buffer asetat pH 5 dan kemudian ditambahkan 20 tetes larutan Ninhidrin dalam aseton. Dipanaskan larutan tersebut diatas penangas air mendidih selama beberapa menit, diperhatikan warna yang terjadi.

2.      Uji Biuret

Didalam tabung reaksi ditambahkan 1mL albumin 2% dan 1mL NaOH 10%, diaduk kuat-kuat. Ditambahkan 1 tetes CuSO_4, diaduk baik-baik. Jika tidak timbul warna ditambahkan lagi beberapa tetes CuSO₄ sampai terbentuk warna ungu.

Kedalam tabung reaksi, dimasukan urea sedikit dan dipanaskan hingga melebur. Kemudian didinginkan dan diperhatikan baunya. Larutan urea yang telah didinginkan tersebut diatas dengan air, kemudian dilakukan reaksi biuret seperti pada cara 1.

3.      Pengendapan dengan logam berat

Didalam 1mL larutan albumin ditambahkan tetes demi tetes larutan CuSO₄ 2% hingga terjadi endapan. Diperhatikan perubahan yang terjadi pada setiap kali penetesan. Diperhatikan pula apakah endapan terbentuk, dan apakah endapan yang terbentuk larut kembali atau ditambahkan dengan penambahan reagen yang berlebih. Diulangi setiap percibaan (1) untuk larutan 2% Pb-asetat, 2% HgCl₂, 2% FeCl₃, dan 2% CuSO₄.

4.      Titik isoelektrik protein

Kedalam tabung reaksi masing-masing ditambahkan 5mL larutan 0,5% kasein (air susu). Kemudian pada tabung tersebut masing-masing tabung ditambahkan buffer asetat pH 6,0; 5,3; 5,0; 4,1; dan 3,8. Kemudian dikocok campuran tersebut secara baik-baik, kemudian dicatat derajat kekeruhan setelah 0 menit, 10 menit, dan 30 menit. Setelah 30 menit kelima tabung tersebut dipanaskan didalam penangas air mendidih selama 30 menit. Pembentukan endapan atau kekeruhan paling cepat terjadi dekat titik isoelektrik larutan protein. Diperhatikan apa yang terjadi kemudian dicatat.

 

VII.    Data pengamatan

1.      Uji Ninhidrin

Larutan yang diuji	Hasil	Katerangan
Albumin + buffer asetat pH 5 + 20 tetes larutan Ninhidrin	Ungu kebiru-biruan	Positif

Kesimpulan : terdapat reaksi asam amino pada sampel albumin

2.      Uji Biuret

Larutan yang diuji	Hasil	Keterangan
1mL albumin + 0,1% CuSO4 + 10% NaOH	Ungu pada tetes ke 1	Larutan tidak ada endapan tetapi berubah warna menjadi warna ungu.

kesimpulan : terdapat rantai peptida pada sampel

3.      uji pengendapan dengan logam berat

Larutan yang diuji	Hasil	Keterangan
Albumin + 0,2% CuSO4	Endapan tetes ke 2	Adanya perubahan warna biru muda
1mL albumin + 2% Pb asetat	Endapan tetes ke 1	Adanya endapamn putih
1mL albumin + 2% NaCL2	Endapan tetes ke 6	Ada endapan tetapi larutan bening
1mL albumin + 2% FeCl3	Endapan tetes ke 3	Ada endapan menjadi orange
1mL albumin + 2% CuSO4	Endapan tetes ke 5	Ada endapan warna berubah menjadi warna biru muda

kesimpulan : logam berat dapat mendenaturasi protein hingga terbentuk protein

4.      Uji titik isomerelektrik

Larutan uji	0 menit	10 menit	30 menit	Dipanaskan
Kasein + pH 6,0	+	++	+++	Keruh
Kasein + pH 5,3	+	++	+++	Keruh
Ka sein + pH 5,0	+	++	+++	Bening, ada endapan
Kasein + pH 4,1	+	++	+++	Bening, ada endapan
Kasein + pH 3,8	+	++	+++	Keruh

Kesimpulan : Titik isoelektrik terdapat pada pH 5,0 dan 4,1

VIII.       Pembahasan

Protein (akar kata  protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer  asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus.  Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. Jenis protein lain berperan dalam fungsi struktural atau mekanis, seperti misalnya protein yang membentuk batang dan sendi sitoskeleton. Protein terlibat dalam sistem kekebalan (imun) sebagai antibodi, sistem kendali dalam bentuk hormon, sebagai komponen penyimpanan (dalam biji) dan juga dalam transportasi hara. Sebagai salah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam amino bagi organisme yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut (heterotrof).

Pada praktikum kali ini dilakukan beberapa pengujian pada protein diantaranya uji Ninhidrin, uji Biuret, uji pengendapan dengan logam berat, dan uji titik isoelektrik protein.

Uji pertama yang dilakukan yaitu uji Ninhidrin, yang bertujuan untuk mengetahui ada atau tidaknya asam amino pada sampel yang diujikan. Dari data pengamatan didapat zat yang diujikan yaitu albumin + buffer asatat pH 5 + 20 tetes larutan Ninhidrin, kemudian menghasilkan warna ungu kebiru – biruan, maka hal tersebut menandakan adanya reaksi asam amino pada sampel albumin. Asam amino yang mengandung asam alfa amino akan memberikan reaksi dengan larutan  Ninhidrin membentuk warna biru. Pertama kali terjadi oksidasi alfa amino oleh larutan Ninhidrin. Kemudian terjadi kondensasi antara amonia, larutan Ninhidrin tereduksi dan larutan Ninhidrin membentuk senyawaa kompleks berwarna biru.

pada pengujian ke dua dilakukan uji Biuret yang bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya rantai peptide pada sampel yang diujikan. Sampel yang diujikan yaitu 1mL albumin + 0,1% CuSO₄ + 10% NaOH menghasilkan warna ungu pada tetes ke satu, pada larutan tersebut tidak terdapat endapan, tetapi larutan barubah warna menjadi warna ungu. Hal ini disebabkan penambahan CuSO₄ sehingga terbentuk kompleks antar Cu²⁺ dengan gugus amino dari protein. Semakin kuat intensitas warna ungu yang dihasilkan ini menunjukan makin panjang ikatan peptidanya. Sedangkan penambahan NaOH pada protein telur agar bersifat basa. Bahwa jika protein didihkan dengan asam kuat atau basa kuat yang pekat, molekulnya akan terhidrolisis menjadi molekul asam amino. Oleh sebab itu kemungkinan penambahan NaOH agar protein terurai menjadi asam amino. Sedangkan penambahan CuSO4 berfungsi sebagai uji positif terhadap ikatan peptida, jika terbentuk warna ungu berarti sampel tersebut mengandung protein.

pada pengujian selanjutnya dilakukan uji pengendapan dengan logam berat. Dari hasil percobaan didapat data pengamatan dari sampel albumin yang diujikan dengan logam logam seperti CuSO₄, Pb asetat, HgCl₂, FeCl₂, dari data pengamatan didapat Pb asetat dan HgCl₂ menghasilkan endapan berwarna putih. Pada uji pengendapan logam dihasilkan endapan berwarna putih dan larutan keruh. Endapan yang terbentuk merupakan endapan yang berasal dari protein yang diuji, endapan ini terjadi karena adanya reaksi logam Pb dengan protein. Logam Pb ini merupakan logam yang mengandung ion positif. Dimana salah satu sifat dari logam yang mengandung ion positif dapat menghasilkan endapan jika direaksikan dengan protein. Sama halnya dengan Hg yang juga merupakan logam yang mengandung ion positif yang juga dapat menghasilkan endapan jika direaksikan dengan protein.

Pada pengujian terakhir yaitu dilakukan pengujian titik isoelektrik, titik isoelektrik tersebut dapat ditentukan dengan kekeruhan atau adanya endapan pada larutan. Dari data pengamatan yang didapat setelah dilakukan percobaan, adanya endapan pada larutan tersebut pada pH 5,0 dan pH 4,1. Pada titik isolistrik protein mempunyai muatan positif dan negatif yang sama, sehingga tidak bergerak ke arah elektroda positif maupun negatif apabila ditempatkan di antara kedua elektroda tersebut.

IX.       Kesimpulan

Pada pengujian Ninhidrin dengan zat uji albumim + buffer asetat pH 5 + 20 tetes larutan Ninhidrin menghasilkan warna ungu kebiru biruan, pada uji tersebut terdapat reaski asam amino pada sampel. Pada pangujian uji biuret dengan zat uji albumin + 0,1% CuSO₄ + 10% NaOH mengahsilkan warna ungu pada tetes ke-1, pada larutan tidak terdapat endapan tetapi berubah menjadi warna ungu, maka terdapat rantai peptide pada sampel.

Pada pengujian uji endapan dengan logam berat, logam berat dapat mendenaturasi protein sehingga dapat terbentuk protein. Pada pengujian titik isoelektrik dengan menggunakan kasein, titik isoelektrik terjadi pada pH 4,1 dan pH 5,0.

 

X.          Daftar Pustaka

Fessenden, Ralph J., Joan S. Fessenden, 1997, Dasar-dasar Kimia Organik, Binarupa Aksara, Jakarta.

Girindra, A., 1986, Biokimia I, Gramedia, Jakarta.

Page, D., S., 1998, Prinsip-prinsip Biokimia, Erlangga, Jakarta.

Poedjiadi, A., 1994, Dasar-dasar Biokimia, Universitas Indonesia Press, Jakarta.